الجزيئي طريقة الأبحاث الجينية

لاستكشاف وتحديد المتغيرات في بنية الحمض النووي الوراثي الجزيئي طريقة استخدامها. لكل منطقة DNA، الذي يستكشف هذه المنطقة من كروموسوم، الجين أو أليل، وأساليب تختلف. وراء كل طريقة الوراثي الجزيئي تضم بعض أو غيرها من التلاعب RNA والحمض النووي. وتتميز جميع هذه الأساليب من قبل التعقيد الهائل، بدونها لا يمكن أن يتم من ظروف المختبر، ويجب أن يكون الموظفين المؤهلين تأهيلا عاليا. ويتم هذا العمل في عدة مراحل.

مراحل

أولا، RNA أو DNA العينات التي يتم إنتاجها. هنا، يمكن تطبيق طريقة الوراثي الجزيئي لأي مادة تقريبا: قطرة من الدم، كريات الدم البيضاء، الخلايا الليفية والثقافة، والغشاء المخاطي (كشط)، حتى بصيلات الشعر، و- DNA يمكن الحصول عليها من أي عينة. انها مناسبة لاستخدام أي وسائل الوراثية الجزيئية وخياراتها المختلفة والتي يتم تخزين الحمض النووي معزولة لفترة طويلة المجمدة. وتكرس المرحلة الثانية لتراكم شظايا المطلوب (التضخيم) من الحمض النووي، كما أنه يساعد على ضمان تفاعل البلمرة في المختبر (في المختبر دون تدخل من الكائنات الحية). ونتيجة لذلك، اختار تتكاثر DNA جزء من هذا سلسلة من ردود الفعل، وزادت كمية DNA حرفيا ملايين المرات.

يفترض الخطوة الثالثة في أساليب الأبحاث الجينية الجزيئية تقييد تضاعفت DNA (هذا التشرذم، وتمزيق أو قطع). تقييد إجراء من قبل الكهربائي على بولي أكريلاميد أو هلام الاغاروز. هذه الطريقة الجزيئية الجينية لدراسة جزء DNA يسمح الجميع لاتخاذ موقف معين في هلام. بعد ذلك، يتم التعامل مع هلام مع بروميد إيثيديوم، وقادرة على الالتصاق DNA، وأشعة مع الأشعة فوق البنفسجية، فمن الممكن لمراقبة أجزاء التلألؤ. طرق التشخيص الجينية الجزيئية متنوعة وعديدة، ولكن الخطوات الأولى والثانية هي مشتركة بين الجميع. ولكن من أجل تحديد شظايا الحمض النووي، والجل يمكن أن تكون ملونة، والعديد من الأساليب الأخرى القائمة.

نوع

ويمكن أن تشمل الأساليب الأكثر مباشرة وواسعة النطاق للكشف عن المتفطرات الجزيئية طريقة التعلم DNA الوراثية أعلاه. جوهرها هو أنه، من أجل تحديد المواد سلسلة مسح شظايا محددة من الحمض النووي من مسببات الأمراض. تقنيات التشخيص الجينية الجزيئية ليس لديها حتى الآن وسيلة أكثر كفاءة للاعتراف أمراض مثل السل. باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، يمكنك أن تكون على يقين من أن DNA الأصلي سوف تزيد من عدد النسخ في مليون مرة، وهذا هو، وسوف يكون هناك تضخيم، وأنه سيتم عرض النتائج. مستوى حساسية عالية جدا - أكثر من خمسة وتسعين في المئة، وهو الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب.

بقية الأساليب الجزيئية الوراثية من البحوث حول فعالية العائد نسخ متعددة تضاعف حرفيا، لأنه في هذه الحالة تظهر عينة صياغة زادت سلسلة النوكليوتيد محددة إلى مائة وستة أضعاف. حتى التشخيص ثقافة السل في الجهاز التنفسي أقل بكثير حساسيتها. وهذا هو السبب ويستند الطب الحديث على الطرق الوراثية الجزيئية للتشخيص السل. وهناك طريقة وصفها هو فعالة بشكل خاص عند التعامل مع مسببات الأمراض تقلب الأنتيجين عالية، تحديد أن طريقة أخرى أكثر صعوبة - يتطلب خاصة وسائل الإعلام الغذائية وزراعة فترة طويلة. الأساليب الوراثية البيوكيميائية والجزيئية تنتج تأثير مختلف جدا عن النتائج.

تشخيص مرض السل

التشخيص مارشال PCR السل الأكثر شيوعا تستخدم تلك تسلسل الحمض النووي التي هي محددة لجميع أربعة أنواع من هذا المرض. ولتحقيق هذا الهدف غالبا ما تستخدم الاشعال التي كشف التسلسل عناصر (IS-986، IS-6110)، وهذه العناصر تتميز الأنواع الكثيرة الارتحال السل المتفطرة ودائما عدة نسخ موجودة في الجينوم. ويمكن أيضا أن يتم استخراج الحمض النووي من ثقافات نقية والسريرية (البلغم من المرضى) بأي طريقة مناسبة أخرى. على سبيل المثال، هناك طريقة بوم حيث يتم استخدام تحلل العازلة على أساس ثيوسيانات جوانيداين والسيليكا باسم DNA الناقل. وقد لعب طريقة الجزيئات الجينية لدراسة الحمض النووي دورا كبيرا في تشخيص: عدد المرضى التي تختلف الفقيرة البكتريولوجية زيادة كل عام، وبالتالي في الممارسة السريرية أنشأت مستوى مختلف تماما من التنظيم.

ومع ذلك، يجب أن نعترف أنه لا يخلو من العيوب. طريقة PCR هو استخدام كثير من الأحيان يجلب عدد كبير من نتائج إيجابية كاذبة، والسبب ليس أخطاء فنية فقط، ولكن أيضا ملامح الأسلوب نفسه. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام هذا الأسلوب من التشخيص لتحديد الجدوى من المتفطرات، التي تم تحديدها، فمن المستحيل بكل بساطة. ولكن هذا العيب ليس الأكثر أهمية. الأساليب الوراثية الجزيئية للتشخيص PCR يترتب على مخاطر تلوث DNA الفطرية. متطلبات الاعتماد لهذا السبب للمختبرات PCR مصمم الصعب حصرا، فهي تتطلب ثلاثة أماكن منفصلة. تقنية PCR حديثة ومعقدة جدا، ويتطلب استخدام المعدات المناسبة والموظفين المدربين عالية.

bacterioscopy

عندما يجب مقارنة نتائج التشخيص للتحليل مع بيانات أخرى: الفحص السريري، التصوير الشعاعي، الفحص المجهري لطخة، والمحاصيل، وحتى استجابة لعلاج محدد هي مهمة جدا. في هذه السلسلة، والدراسات PCR ليست سوى واحدة من المكونات. الكشف عن العوامل المسببة للأمراض في التشخيص المبكر يمكن أن يكون أبسط وأسرع الطرق - الجرثومية.

يستخدم هناك المجهر الضوئي (تلوين تسيل-نلسن) والفلورسنت (fluorochromes التلوين). ميزة هي سرعة تشويه النتائج. ولكن العيب يعتبر بحق قدرة محدودة نظرا لحساسية منخفضة. ومع ذلك، وتعطى هذه الطريقة توصية منظمة الصحة العالمية بأنها الأكثر اقتصادا والأرض للكشف عن مرضى السل. الكشف عن المتفطرات طريقة البكتريولوجي له قيمة التنبؤ ويقدر إفراز البكتيريا كميا. كثيرا أكثر ثقة للتعامل معها طرق البحث الوراثية الجزيئية لمرض السل.

الثقافات

كشف أفضل من المتفطرات تعترف الدراسات الثقافية. زرع المواد المرضية ويتم ذلك في المتوسط البيض: Mordovsky، فين II، LJ، وما شابه ذلك. معايير للمقاومة من المتفطرات على الأدوية وأدلة غير مباشرة لفعالية عدد من المتفطرات ومستعمراتها في المختبر، وإذا كانت طريقة تطبيقها من ثقافة البحث العلمي. لزيادة نسبة عزل التلقيح المتفطرات المواد المرضية والتي عقدت في بيئات متعددة.

تلبية احتياجات العديد من الثقافات، الممرض بما في ذلك المنح والسوائل. المستخدمة في هذا النظام وآلية نوع قياس النمو VANTES. يجب أن تعقد المحاصيل في الحضانة لمدة تصل إلى سبعة إلى ثمانية أسابيع. وبحلول ذلك الوقت المحصول مع عدم وجود نمو يمكن اعتبار السلبي. أنجع وسيلة للكشف عن المتفطرة السلية تعتبر العينات البيولوجية: التشخيص المواد تصيب الخنازير الغينية، والتي هي عرضة للإصابة بالسل للغاية.

بعض الأرقام

كان الحقل مثيرة للاهتمام من الدراسة، الذي افتتحه التشخيص PCR لدراسة مرض السل M. - العدوى الكامنة. المفهوم الحديث للعدوى السل يوحي بأن من مائة شخص كانوا على اتصال مع M. السل وتسعون قد يكون جيدا المصابة، ولكن فقط عشرة منهم ويجري تطوير مرض نشط. آخرون لديهم مناعة السل، ولأن تسعين في المئة من الحالات العدوى لا يزال كامنا. الكشف عن نمط ساعدت على طريقة الوراثي الجزيئي.

ويقول علماء الوراثة أن خمسة وخمسين في المائة من أولئك الذين المحاصيل المرضية المواد كانت سلبية، وثمانين في المئة من المصابين M. السل، ولكن تفيض لأي مظاهر التصوير الشعاعي للمرض، تلقت ردود فعل إيجابية PCR. وهي طريقة التشخيص الجيني ساعدت على تحديد المرضى للخطر من خلال الدراسات PCR، مع نتائج تحليلاتهم (المجهري والثقافة) والسلبي، وكان العدوى تحت السريرية M. السل الحالي.

البحوث الحديثة

الاتحاد الروسي والمختبرات الجرثومية استخدام طريقة المتسارع للتركيزات المطلقة: النشاط اختزال النترات من المتفطرات اختبارها من قبل Griess كاشف. مراكز-TB مكافحة استخدام الأسلوب الذي يسمح لتحديد مقاومة الأدوية. هذا البذر في وسائل الإعلام السائلة، حيث الآلي الإشعاعي ونظام المحاسبة الفلورسنت نمو المتفطرات. هذا ويتم تحليل بسرعة - ما يصل إلى أسبوعين.

ويجري حاليا تطوير أساليب جديدة: يتم قياس مقاومة المخدرات من المتفطرات على المستوى الوراثي. دراسة الآليات الجزيئية من الجينات المقاومة ويظهر وجود في المتفطرات. وترتبط هذه الجينات مع المقاومة لأدوية معينة. على سبيل المثال، الجينات كاسا، inhA، مقاومة الإيزونيازيد، الجينات rpoB katG - الجينات RNA 16Sp ريفامبيسين وrpsL - الستربتومايسين، emb1 - لالإيثامبوتول، gyrA - الفلوروكوينولون وهلم جرا.

الطفرات

التشخيص الحديثة زيادة كبيرة في طريقة الجزيئي الوراثي مستوى لدراسة الحمض النووي والسماح للإجراء دراسات واسعة النطاق من الطفرات في كل الطيف. نحن نعرف الآن أن الطفرات الأكثر شيوعا في 516، 526 و 531 الكودونات الجين rpoB، وحددت مقاومة للعقاقير المختلفة. هناك مجموعة واسعة من الأساليب للكتابة من المتفطرات باستخدام الطرق التقليدية ليس فقط - الكيمياء الحيوية والبيولوجية والثقافية، ولكن أيضا تستخدم على نطاق واسع التقنيات الوراثية الجزيئية الحديثة. إذا هناك كافية وتوفير طريقة التشخيص الصحيح للكشف عن الأمراض أحادية المنشأ. وهي تستند إلى دراسات الحمض النووي في المنطقة المحددة لجين معين. هذا عادة ما يكون عملية معقدة، وتستغرق وقتا طويلا ومكلفا، ولكن البيانات التي يتم توفيرها عن طريق التحليل الجيني الجزيئي، هو أكثر دقة وغنية بالمعلومات من البيانات من جميع التحليلات الأخرى.

منذ فترة طويلة كان من المعروف أن الحمض النووي لا يغير لحياة كاملة من الكائن الحي أنه في أي خلايا odnakova منوى، وهذا يجعل من الممكن اتخاذ تحليل كل الخلايا تماما من الجسم، في أي مرحلة من مراحل تطور الجنين. يمكن الكشف عن الجين التالف قبل ظهور الأعراض الأولى للمرض السريري واسعة النطاق، وكذلك في الناس متخالف صحية، ولكن وجود طفرة في جين. طرق التشخيص مرض وراثي جيني الجزيئية تسمح للكشف في (النهج المباشر، DNA والتشخيص)، وكذلك لتحليل الفصل المرض في الأسرة مع علامة مواضع الحمض النووي (الأشكال الوراثية)، والتي ترتبط ارتباطا وثيقا مع الجينات التالفة (أي نهج غير المباشر DNA والتشخيص). مباشر أو غير مباشر - يستند أي تشخيص DNA على طرق تحديد جزء محددة بدقة من الحمض النووي البشري.

الطرق المباشرة

طرق مباشرة لتشخيص DNA هي عندما يعرف مرض وراثي الجاني الجينات، وكما هو معروف جيدا، وأنواع الطفرات لها. على سبيل المثال، الأساليب المباشرة مناسبة في عدد من الأمراض. هذا رقص هنتنغتون (تمديد CTG-يكرر)، بيلة الفينيل كيتون (R408W)، والتليف الكيسي (delF508، والطفرات الكبرى) وما شابه ذلك. والميزة الرئيسية للطريقة المباشر هو دقة التشخيص مملوكة بالكامل، وليس هناك حاجة إلى القيام بتحليل الحمض النووي لبقية أفراد الأسرة. إذا تم العثور على طفرة في الجين المقابل، فإنه يسمح يوافق بالضبط تشخيص الوراثة، وتحديد النمط الجيني لبقية أفراد الأسرة مثقلة.

يعتبر ميزة أخرى لتشخيص المباشر لتحديد الناقل متخالف من الطفرات السيئة من الأقارب والوالدين الذين لقوا حتفهم من جراء هذا المرض. هذا ينطبق بشكل خاص لأمراض جسمية متنحية. وتتوفر أيضا مساوئ الطرق المباشرة. لتطبيقها، عليك أن تعرف بالضبط توطين هذا الجين غير طبيعي، هيكل اكسون-إنترون الطيف والطفرات لها. لا تلقى جميع الأمراض أحادية المنشأ اليوم هذه المعلومات. لا يمكن اعتبار أساليب مباشرة Informativeness كاملة، لأن واحدة ونفس الجين قد يكون عدد كبير من الطفرات المرضية التي تسبب تطور أمراض وراثية.

الأساليب غير المباشرة

وتستخدم وسائل غير مباشرة في التشخيص DNA في كل شيء، في حالات أخرى، إذا لم يتم التعرف على الجينات التالفة، ولكن فقط صبغويا، أو إذا كان التشخيص الخط لم يعط نتيجة (يحدث، إذا كانت المنظمة الجزيئية المعقدة الجينات أو إلى حد كبير، إذا كان هناك الكثير الطفرات المرضية). أداء وسائل غير مباشرة تحليل الفصل بين علامات متعددة الأشكال في الأسرة أليلية. علامات وجدت في المنطقة الكروموسومات نفسها أو مكان يرتبط ارتباطا وثيقا المرض وتمثل الحذف أو الإدراج، بدائل نقطة، يكرر، ويرجع ذلك إلى كمية مختلفة من الخلايا في كتلة تعدد الأشكال الخاصة بهم.

الأكثر ملاءمة لتشخيص تعتبر الصغرية وساتل الأشكال غير المباشرة، والتي يتم توزيعها على نطاق واسع في الجينوم البشري. أعربت قيمتها في المحتوى المعلوماتي عالية، إذا كان الضرر لبعد المسافة الجينية بين علامة والجينات ليست كبيرة جدا. وفي الحالة الأخيرة، يتم تحديد دقة تقدير إلى حد كبير وتيرة إعادة التركيب بين علامة متعددة الأشكال والضرر. كما توفر طرق التشخيص غير المباشرة خطوة تمهيدية إلزامية الترددات أليل للدراسة السكان تحليلها بين المرضى وحاملي الطفرات، بالإضافة إلى ضرورة تحديد احتمال إعادة التركيب من nonequilibrium والتصاق علامات والأليلات متحولة.

أساليب أخرى

شرائح قصيرة من الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي، فضلا عن جين واحد تصور تحت الدراسة المجهرية لا يمكن أن يكون، بالتالي، إلى تحديد الطفرات التي تحتاجها التشخيص الوراثي الجزيئي. هناك "مشروع الجينوم البشري"، فضلا عن التطورات الأخرى في مجال علم الوراثة الجزيئية توسع كبير في إمكانية تشخيص الأمراض الوراثية - على حد سواء قبل وبعد الولادة. ويمكن لهذه الأساليب توفير الكشف المبكر وجعل بولي التنبؤ والأمراض أحادية المنشأ، الذي يقام في مرحلة البلوغ لاول مرة. للأسف، بسبب القدرات التقنية للدراسات الجينية الجزيئية تكون في بعض الأحيان خارج حدود الأخلاقية التي تم تعيينها في ما يتعلق الميراث، وخصوصا عندما يكون التشخيص في مرحلة المراهقة والطفولة.

شذوذ الكروموسومات الهيكلية والعددية هي الأسباب الأكثر شيوعا من المرض والسرطان، والعديد من التشوهات. تحتاج الانحرافات الكروموسومية الكشف عن هويته، وهو أمر مهم للالإرشاد الأسري - لتقييم توقعات، جنبا إلى جنب مع خطر الإنجاب في حالات الحمل المستقبلية. تحليل كروموسوم هو "المعيار الذهبي" من التشخيص الوراثي، لكنه محدود. فقط أساليب التحليل الجيني الجزيئي يمكن أن تفعل أكثر من ذلك، لأن هناك استخدام تكنولوجيا الاستنساخ على أساس العلامات الفلورية قادرة على حساسية عالية لتحديد التغيرات الكروموسومية الدقيقة التي من المستحيل للكشف عن الكلاسيكية الدراسات الوراثية الخلوية. هذه التقنيات تتوسع بشكل متزايد قدرات التشخيص لدينا، عندما درست، والأطفال ذوي العاهات الخلقية والتخلف العقلي، مع العديد من أمراض وراثية أخرى.

النتائج

من المهم جدا للبشرية كانت بنية الجينات وظيفة المعرفة، وأنواع التغير، والقدرة على اكتشاف الأمراض الوراثية التي وقعت في اتصال مع تطور علم الوراثة الجزيئي. وتهدف أساليبها في دراسة جزيء DNA - وعندما أمر طبيعي، وعندما كان تالفا. إعداد تسلسل الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين من النيوكليوتيدات (DNA) ويمتد على مراحل من الحصول على عينات لتحديد الأجزاء الفردية. عزل الحمض النووي الجيني من الخلايا، وتقييد (تمزق)، والتضخيم (الاستنساخ)، الكهربائي من شظايا (فصل عهدتهم الكهربائية والوزن الجزيئي من قبل agarose هلام). تحديد أجزاء معينة تقع على سطح شريط منفصلة.

ثم الدخول في مرشحات خاصة الفعل، التي من خلالها يمر كل التهجين جزء مع شظايا الحمض النووي المستنسخة أو تحقيقات المشعة الاصطناعية هو السيطرة، والتي سوف يكون مساويا للكل عينة الاختبار. إذا قمت بتغيير موقف أو طول مقارنة مع لجنة التحقيق، إذا كان جزء جديد أو اختفوا - كل هذا يشير إلى أن الجين تحليل خضع لإعادة الهيكلة في تسلسل النوكليوتيدات. هناك ثمانية التقنيات الأساسية من الدراسات الجينية الجزيئية: التسلسل (تحديد تسلسل DNA) وتفاعل البلمرة المتسلسل (زيادة في عدد متواليات)، وإعداد الاشعال المعروف الجينات، والاستنساخ DNA، وإنتاج جزيئات المؤتلف المستمدة من البروتينات بسبب جزيئات المؤتلف، وخلق مجموعة كاملة (جمع المكتبة) المستنسخة الشظايا التي تم الحصول عليها باستخدام قيود.